荧光定量PCR（qPCR）是实验室常用的一种技术，该技术可以应用于基因表达分析、基因分型、 病原体检测、SNP分析等。qPCR实验操作简单，原理易懂，但面对一堆凌乱的数据，如何进行结果分析成了头疼的问题，今天小翌将带你学会如何化繁为简，轻松获得可以发表SCI的数据！
qPCR常用的分析方法有相对定量和绝对定量，需根据不同的实验设计进行选择。本期我们关注的是qPCR常见的应用—基因表达分析，一般选择相对定量法。
实验设计
假设目前需要研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达的影响，以未经过任何处理的拟南芥植株作为对照组，实验组为经过一定光诱导处理过的植株，分别提取RNA进行反转录，以得到的cDNA为模板，选择拟南芥GAPDH基因作为内参，进行qPCR实验。
需要设置的qPCR孔如下：
1) NTC用来验证PCR体系中是否存在污染；
2) NRT是指用未经反转录的RNA作为模板，是对gDNA残留的控制；
3) 内参基因用来校正因样品初始浓度不同而造成的差异；
4) 而对照样品的选择一般有以下几种情况：
a. 某处理方法对基因表达的影响，将未处理的样本作为参照样本；
b. 检测基因在不同时间的表达差异，将0时刻的样本作为参照样本；
c. 比较基因在不同组织中的表达差异，人为选定一个组织作为参照样本。
这里需要注意的一点是，上面每个材料都设置了3个PCR孔(1、2、3)，这是PCR重复，即技术性重复，是为了消除操作误差，正确评估扩增效率。此外还需设置生物学重复，即不同的材料（时间、植株、批次、反应板）做的同一实验，目的是校准生物学误差，分析处理是否具有统计意义。具体到本例中，实验组和对照组都需要至少再处理两组拟南芥样本（A、B、C），分别提RNA进行逆转录，再做qPCR，统计时以三个生物学重复的平均值进行分析。
结果分析—△△Ct法
△△Ct法的特点是只依靠Ct值来计算结果，但前提是目的基因与内参基因的扩增效率较为一致并且都在90-110%之间。
具体的计算公式为：
△Ct= Ct（目的基因）- Ct（内参基因）
△△ Ct= △Ct（实验组）- △Ct（对照组）
RQ=2^-△△Ct
假设上面研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中，qPCR的结果如下：
计算时，首先我们把对照组的2^-△Ct数据求平均值（上图中为0.00116），然后用2^-△Ct中的每一个数据除以这个平均值，即得到2^-△△Ct的值，最后再整理得到平均值与标准差，表明实验组目的基因表达量相比对照组提高了约9.73倍。
结果用Graphpad软件作图如下：
利用软件的t检验计算出P value=0.0024