本发明涉及一种合成肌肽的方法，具体是一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

l-肌肽(β-丙氨酰-l-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明l-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

目前l-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的l-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到l-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的l-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为l-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，l-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-l-组氨酸，经催化氢化还原得l-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求严格。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。

目前，已有采用温和环保的酶催化合成取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与l-组氨酸一步合成l-肌肽(申请公布号为cn107217048a的专利文献)。该方法依然需要将β丙氨酸甲酯化，并且反应液中合成的l-肌肽会被氨肽酶降解为β-丙氨酸和l-组氨酸，同时，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法，该方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的应用潜力。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法，该以β-丙氨酸、l-组氨酸、atp和聚磷酸盐为原料，mgcl2为激活剂，加入l-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，在ph值为6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成l-肌肽。

具体地，包括以下步骤：

(1)分别构建l-氨基酸连接酶的基因重组表达载体pet-ywfe和聚磷酸盐激酶的基因重组表达载体pet-ppk，其中，l-氨基酸连接酶基因来源于bacillussubtilisbgsc3a2，gi：1094636766，该序列经密码子优化后如seqidno.1所示；聚磷酸盐激酶基因来源于e.colik-12(mg1655)，其核苷酸序列为seqidno.2所示。

(2)分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)，获得基因工程重组菌株e.colipet-ywfe和e.colipet-ppk。

(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达的l-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶的菌体。

重组菌株中的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2％接种至含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至od600达到0.6-0.8时添加终浓度0.2-0.5mmiptg，于25℃诱导培养8-10h，收集菌体。

作为优选，所述lb培养基每升包括10g氯化钠，5g酵母粉，10g蛋白胨，ph7.2-7.4。

(4)破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；

(5)将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150mmβ-丙氨酸、80-150mml-组氨酸、5mmmgcl2、3.0-6.0mmatp和30-50mm六偏磷酸钠的催化液中，在ph值为6.5-8.5,温度为30-45℃条件下进行酶促反应合成肌肽。

所述催化液为50mm磷酸缓冲液中含有浓度为100mmβ-丙氨酸、100mml-组氨酸、5mmmgcl2、5mmatp和50mm六偏磷酸钠。

本发明方法利用大肠杆菌分别表达l-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。l-氨基酸连接酶催化β-丙氨酸和l-组氨酸合成l-肌肽，同时伴随着atp去磷酸化形成adp，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给adp形成atp，从而实现atp的循环再生。利用上述双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应6h可以得到31mml-肌肽。

上述的l-肌肽制备方法所得催化体系中l-肌肽的检测方法为：取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl0.2m硼酸缓冲液(ph＝9.0)，加入300μl1.5mg/mlfmoc-cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上hplc进行测定。

色谱分析条件：zorbaxodsc18柱，上样量20μl；流动相组成：a：乙腈；b:50mm醋酸钠缓冲液ph4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％a，66％b；3-10min，45％a，55％b；10-20min，60％a，40％b；20-30min，100％a；30-40min，100％a。

本发明的方法，由序列优化过后的l-氨基酸连接酶基因在大肠杆菌中成功获得表达，并能一步催化β丙氨酸和l-组氨酸合成l-肌肽。底物无需经过甲酯化或者基团保护；催化反应中所需要的atp由聚磷酸激酶催化adp磷酸化不断再生，只需消耗少量的adp即可实现atp的循环再生；且再生原料六偏磷酸钠来源广泛，成本低廉，操作简单，易于规模化生产。

附图说明

图1为双酶偶联反应示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明利用大肠杆菌分别表达l-氨基酸连接酶和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系。l-氨基酸连接酶催化β-丙氨酸和l-组氨酸合成l-肌肽，同时伴随着atp去磷酸化形成adp，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给adp形成atp，从而实现atp的循环再生，如图1所示。具体步骤：

一、重组l-氨基酸连接酶菌株构建

1.1：根据gi号为gi：1094636766的l-氨基酸连接酶基因序列，经密码子优化后，在优化序列5’端添加ndei酶切位点，3’端添加xhoi酶切位点，形成如seqidno.1所示序列。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2：使用限制性内切酶ndei和xhoi双酶切步骤1中的基因片段及pet-28a载体，胶回收目的片段，并用t4dna连接酶连接两个基因片段，得到重组表达载体pet-ywfe。

1.3：将步骤2中的重组表达载体转化e.colibl21(de3)中，获得产表达的l-氨基酸连接酶菌株e.colipet-ywfe。

二、聚磷酸激酶表达菌株构建

2.1：以e.colik12基因组为模板，用引物对5’-ggatccatatgggtcaggaaaagctatac-3’、5’-cgcggatccggtaccttattcaggttgttcgag-3’扩增ppk基因片段。所述引物分别包含酶切位点ndei和bamhi，形成如seqidno.2所示序列。

2.2：使用限制性内切酶ndei和bamhi双酶切步骤1中获得的目的片段及pet-15b载体，胶回收相应目标片段dna。

2.3：使用t4dna连接酶连接步骤2中的两个基因片段，得到重组载体pet-ppk。

2.4：将步骤3获得的重组质粒转化e.colibl21(de3)中，获得表达聚磷酸激酶的e.colipet-ppk。

三、l-氨基酸连接酶和聚磷酸激酶的制备

将步骤一和步骤二中的菌株分别按照1％-2％(v/v)接种到lb培养基中(含50μg/ml卡那霉素用于e.colipet-ywfe，100μg/ml氨苄青霉素用于e.colipet-ppk)，于37℃，200rpm培养至od600达到0.8左右，添加终浓度为0.4mm的iptg，25℃诱导培养10h。

将e.colipet-ywfe发酵液于8000rpm，4℃离心10分钟，收集菌体。使用ph7.4的pbs缓冲液洗涤2次后，再次用缓冲液重悬，加入1％(v/v)triton-100，冰浴，超声波破碎4秒停2秒，维持15分钟。4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液。

将上清液经0.45微米滤膜过滤后，以1ml/min的流速通过nifocurose6ff(imac)树脂后，用同样流速的0.5mnacl，20mmph7.4pbs缓冲液冲洗，再用0.5mnacl和250mm咪唑溶液以同样流速洗脱目的蛋白。

将洗脱的蛋白用ph7.4pbs缓冲液4℃透析脱盐，获得纯化酶液。

e.colipet-ppk的发酵液处理方法按照文献(artificialcells,bloodsubstitutes,andbiotechnology,34:515–521,2006,doi:10.1080/10731190600862886)所述进行处理。

四、双酶偶联催化合成l-肌肽

4.1：配置反应体系，其中ph7.450mm磷酸缓冲液中含有浓度为100mmβ-丙氨酸、100mml-组氨酸、5mmmgcl2、5mmatp和50mm六偏磷酸钠。

4.2：向步骤1中添加纯化的l-氨基酸连接酶与聚磷酸激酶，使得终浓度分别为0.2mg/ml和0.4mg/ml。反应体系在37℃水浴振荡反应6h。

反应液中l-肌肽及底物氨基酸的检测：

取适量体积反应液于15000g离心10min后，取上清液经适当稀释后，取30μl样品混于270μl0.2m硼酸缓冲液(ph＝9.0)，加入300μl1.5mg/mlfmoc-cl乙腈溶液，室温放置10分钟，再加入300μl4mg/ml盐酸金刚烷胺的乙腈：水(1:1)溶液，混匀，0.22μm滤膜过滤，上hplc进行测定。

色谱分析条件：zorbaxodsc18柱，上样量20μl；流动相组成：a：乙腈；b:50mm醋酸钠缓冲液ph4.2；检测波长263nm；流动相总流量1ml/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0-3min，34％a，66％b；3-10min，45％a，55％b；10-20min，60％a，40％b；20-30min，100％a；30-40min，100％a。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

序列表

常熟理工学院

一种利用l-氨基酸连接酶一步法合成l-肌肽的方法

2

siposequencelisting1.0

1

1428

dna

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisbgsc3a2)

1

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2

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大肠杆菌k-12(mg1655e.colik-12mg1655)

2

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