本发明涉及医药化学检测领域，更具体地说，本发明涉及一种小鼠皮层中的8种氨基酸的检测方法。
背景技术：
氨基酸是构成生命体的重要基础物质，脑组织中的氨基酸类神经递质在中枢神经系统中参与调节生理活动，已有研究表明，脑内氨基酸水平的异常与脑部疾病的发生关系密切，如抑郁症、脑缺血、阿尔兹海默症等。天冬氨酸和谷氨酸属于中枢神经系统的兴奋性氨基酸，谷氨酸中枢神经系统中含量最多。它们能够调节脑部的发育，但过量会有神经毒性作用，损伤中枢神经系统。γ-氨基丁酸和甘氨酸属于中枢神经系统的抑制性氨基酸，γ-氨基丁酸由谷氨酸脱羧酶在神经末梢生成，对中枢神经系统起到抑制作用，调节脑内各种神经递质的水平，有抗焦虑的作用。甘氨酸通过作用nmda受体，对脑缺血和空间记忆有双向调节作用；谷氨酰胺具有保护大脑，调节情绪，学习的作用。丝氨酸是合成嘌呤、嘧啶、胆碱的前体物质。精氨酸在脑中促进生长激素的合成。牛磺酸是含硫氨基的氨基酸，在脑内分布广泛，含量丰富，具有改善记忆，促进垂体激素分泌的作用。
目前，对氨基酸的测定常用方法有液相色谱-质谱联用法(hplc-ms)，高效液相色谱法(hplc)。尽管液相色谱-质谱法灵敏度高、特异性好，但其设备价格昂贵而不能广泛使用。通过优化色谱条件、预处理条件，衍生方法来提高高效液相色谱的灵敏度与准确度。本实验以β-氨基丁酸为内标物质，opa为衍生试剂，采用柱前衍生的方法建立一种灵敏度高、分离效能高、操作简便的测定小鼠皮层中氨基酸的方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种小鼠皮层中氨基酸含量的检测方法。
为了实现根据本发明的这些目的，提供了一种测定小鼠皮层中8种氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、标准品的配制；
步骤二、小鼠皮层取样；
步骤三、除皮层样品中的蛋白质；
步骤四、衍生试剂的配制和衍生化反应；
步骤五、hplc-fld分离测定皮层样品中的8种氨基酸；
步骤六、结果计算。
优选的是，步骤一中对标准品的配制的具体方法为：
以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸为标准品，分别用超纯水配制成1.0mg/ml的储备液，备用。
优选的是，步骤二中小鼠皮层取样的具体方法为：
取小鼠断头处死，立即剪开头皮，除去硬脑膜和头盖骨，在冰皿上分离出大脑皮层，用生理盐水洗去残血，吸干水分，称重，在玻璃匀浆器中加入1:1(m/v)体积的去离子水进行匀浆，匀浆液置于-80℃冰箱内保存备用。
优选的是，步骤三中除皮层中的蛋白质的具体方法为：
取步骤二中的皮层匀浆液，加入按1mg/μl的比例体积的内标物β-氨基丁酸(600mg/ml)溶液，加入与皮层匀浆液体积比为1:5的乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，10000×g，4℃离心10min，取上清液，用超纯水稀释20倍供hplc-fld测定。
优选的是，步骤四中衍生试剂opa的配制的具体方法为：
精密称取邻苯二甲醛(opa)16.1mg于10ml的ep管内，加入0.4ml的甲醇溶解，再加入3.57ml的10mmol/l的硼酸钠缓冲溶液(用饱和naoh溶液调ph至10.0)，加入30μlβ-巯基乙醇，涡旋混匀，得浓度为4.0mg/ml的opa溶液，于4℃避光保存备用。
步骤四中衍生化反应的具体方法为：
使用时取100μl标准品工作液或者样品溶液，加入50μl的opa衍生化试剂，立即在室温下涡旋混匀30s，静置1min，进样20μl进行分析。
优选的是，步骤五中hplc-fld分离测定皮层样品中的8种氨基酸，测定条件如下：
检测器：waters2475型荧光检测器
色谱柱：依利特ods(4.6×250mm，5μm)
流动相a：甲醇；
流动相b：乙酸钠水溶液，ph＝6.0
梯度洗脱程序为：0-7min：10％-40％a；7.01-9min：40％a；9.01-10min：40％-60％a；10.01-18min：60％a；18.01-19min：50％a；19.01-20min：70％a；
柱温：35℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：激发波长：340nm发射波长：450nm
进样量：20μl
优选的是，步骤五中结果计算具体为：
按公式(1)计算天冬氨酸的含量；按公式(2)计算谷氨酸的含量；按公式(3)计算谷氨酰胺的含量；按公式(4)计算丝氨酸的含量；按公式(5)计算甘氨酸的含量；按公式(6)计算精氨酸的含量；按公式(7)计算牛磺酸的含量；按公式(8)计算γ-氨基丁酸的含量；
y＝0.072x+0.0019(1)
y＝0.1356x+0.0001(2)
y＝0.3045x+0.0127(3)
y＝0.2231x+0.0127(4)
y＝0.3971x+0.0172(5)
y＝0.1985x-0.0032(6)
y＝0.3577x+0.0028(7)
y＝0.3077x-0.003(8)
式中：
y：待测物与内标物质的峰面积之比；
x：待测物的浓度，单位为微克每毫升。
本发明至少包括以下有益效果：
1.本发明提供的waters-2475型荧光检测器灵敏度高，稳定性好。
2.采用本发明的小鼠皮层中氨基酸的测定，检测过程操作简单方便、结果准确，可实现皮层样品中8种氨基酸的快速测定。
本发明的其他优点、目标和特征将分别通过下面的说明体现。
附图说明
图1为本发明所述实施例中8种氨基酸标准品和内标的高效液相色谱图。其中：1号峰为天冬氨酸、2号峰为谷氨酸、3号峰为谷氨酰胺、4号峰为丝氨酸、5号峰为甘氨酸、6号峰为精氨酸、7号峰为牛磺酸、8号峰为γ-氨基丁酸、9号峰为内标物β-氨基丁酸。
图2为本发明所述实施例中测定小鼠皮层中8种氨基酸和内标的高效液相色谱图。其中：1号峰为天冬氨酸、2号峰为谷氨酸、3号峰为谷氨酰胺、4号峰为丝氨酸、5号峰为甘氨酸、6号峰为精氨酸、7号峰为牛磺酸、8号峰为γ-氨基丁酸、9号峰为内标物β-氨基丁酸。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
＜实施例＞
1仪器
高效液相色谱仪(美国waters公司)
2试剂
水：超纯水(0.45μm水系微孔滤膜滤过)。
甲醇：色谱纯甲醇(美国tedia公司)(0.45μm有机系微孔滤膜滤过)。
乙酸钠溶液：ph＝6.0(0.45μm水系微孔滤膜滤过)。
标准品：天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、精氨酸(arg)、牛磺酸(tau)、γ-氨基丁酸(gaba)(均购自上海阿拉丁试剂有限公司)
内标：β-氨基丁酸(baba)(购自上海阿拉丁试剂有限公司)
3检测方法
(1)标准品和供试样品溶液的制备：
a)标准品溶液的制备：
以天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸为标准品，分别用超纯水配制成1.0mg/ml的储备液，分装置于-20℃冰箱内保存备用。临用时用甲醇稀释成所需浓度，取100μl稀释后的标准品溶液，加入50μl的opa衍生试剂，涡旋30s，放置1min，供hplc-fld测定。
b)供试样品溶液的制备：
小鼠皮层匀浆后分装于于1.5ml离心管中，置于-80℃环境中储存备测。取皮层匀浆上清液样品，加入按1mg/μl的比例的γ-氨基丁酸内标溶液(浓度为600mg/ml)，加入与皮层匀浆液体积比为1:5的乙腈沉淀蛋白，涡旋1min，在4℃条件下，10000×g离心10min，取上清液稀释20倍得到待测生物样品。取100μl待测生物样品，加入50μl的opa衍生试剂，涡旋30s，放置1min，供hplc-fld测定。
(2)高效液相色谱检测
色谱条件：
检测器：waters2475型荧光检测器；色谱柱：依利特ods2(4.6mm×250mm,5μm)；检测波长：激发波长340nm，发射波长450nm；柱温：35℃；进样量为20μl；流动相为甲醇:乙酸钠溶液(ph＝6.0)；梯度洗脱程序为0-7min：10％-40％a；7.01-9min：40％a；9.01-10min：40％-60％a；10.01-18min：60％a；18.01-19min：50％a；19.01-20min：70％a；流速为1.0ml/min。
将标准品储备液在0.05-8μg/ml范围内配制成7个不同浓度的系列标准混合溶液，分别进样测定，以待测物和内标物的峰面积的比值为y，以待测物的浓度为x进行线性回归，8个待测物的线性回归的相关系数γ≥0.9998。
将标准品溶液和匀浆样品溶液分别衍生化后进样，根据各标准品的保留时间确定匀浆样品中各色谱峰的归属；然后以内标法对样品中的氨基酸的含量进行计算。
4结果计算
按公式(1)计算天冬氨酸的含量；按公式(2)计算谷氨酸的含量；按公式(3)计算谷氨酰胺的含量；按公式(4)计算丝氨酸的含量；按公式(5)计算甘氨酸的含量；按公式(6)计算精氨酸的含量；按公式(7)计算牛磺酸的含量；按公式(8)计算β-氨基丁酸的含量；
y＝0.072x+0.0019(1)
y＝0.1356x+0.0001(2)
y＝0.3045x+0.0127(3)
y＝0.2231x+0.0127(4)
y＝0.3971x+0.0172(5)
y＝0.1985x-0.0032(6)
y＝0.3577x+0.0028(7)
y＝0.3077x-0.003(8)
式中：
y：待测物与内标物质的峰面积之比；
x：待测物的浓度，单位为微克每毫升。
5专属性
实验各氨基酸的测定专利条件下，在空白溶剂的色谱图中，在待测物的保留时间处，未见峰，表明此方法具有良好的专属性。
6线性和灵敏度
实验天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸在专利条件下的线性关系，标准曲线表明在测定浓度范围内(0.05，0.1，0.2，1.0，2.0，5.0，8.0μg/ml)响应值和浓度线性关系良好(γ≥0.9998)；各氨基酸的保留时间和线性范围，回归方程见表1(检测限信噪比≥3和定量限信噪比≥10)。
表18种氨基酸的保留时间及线性回归方程
7回收率
回收率通过测定向样品基质中加入已知量的标准品得出。加入0.1μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml三个浓度的标准品，每个浓度5份平行，在一天内测定，用于计算回收率和日内精密度。
8精密度
精密度通过测定向样品基质中加入已知量的标准品得出。加入0.1μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml三个浓度的标准品，每个浓度3个平行，连续测定3天，用于计算日间精密度。用相对标准偏差来表示精密度。
小鼠皮层中添加0.1μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml三个浓度的回收率和精密度见表2。
表2小鼠皮层样品加标(质控样品)的回收率和精密度(均值±标准偏差)
9稳定性
稳定性通过测定向样品基质中加入已知量的标准品得出。加入0.1μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml三个浓度的标准品，每个浓度3个平行，分别于4℃放置0h，24h，48h后测定，当减少量小于10％时，可认为样品稳定。小鼠皮层样品中添加0.1μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml三个浓度在4℃条件下的放置稳定性见表3。实际样品最好在一天内测完。
表3皮层样品加标(质控样品)的稳定性
由以上实例可以看出，本发明实施例通过对小鼠皮层中天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸进行了检测，方法有较高的灵敏度、准确度和精密度。