棘球蚴病俗称包虫病，是一种流行于全球危害极大的人兽共患性寄生虫病，感染人后潜伏期较长[1]，早期预防缺乏有效疫苗[2]，利用虫体蛋白筛选具有保护性表位的抗原，研制早期诊断试剂盒与棘球蚴高效疫苗成为当务之急。通过实验技术筛选具有保护性表位的抗原实验周期长、费用高，随着众多核酸和蛋白质数据库的建立与完善、生物信息学理论与技术不断发展可以大大节省实验经费与时间，提高抗原筛选的效率[3-7]。本研究通过利用生物信息学在线软件对细粒棘球绦虫Eg18的B细胞和T细胞抗原表位进行预测。
1 材料与方法1.1 氨基酸序列的获取将GeneBank中查询得到的Eg18基因序列，经多重比对确定用于分析的Eg18基因(GeneBank Accession No.:AAS00620)，用Primer Premier 5.0软件推测Eg18基因编码的氨基酸序列。
1.2 理化性质预测使用Expasy系统的pr-otparam数据库(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)预测Eg18的理化性质。
1.3 二、三级结构的预测通过在线预测网站Predict Protein(https://www.predictprotein.org/)预测Eg18抗原的二、三级结构。
1.4 B细胞表位的预测利用在线预测软件ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)及LEPS(http://leps.cs.ntou.edu.tw/)综合预测Eg18的B细胞表位。ABCpred是使用递归神经网络算法[8]，将目标抗原固定长度(本研究选用16个)的氨基酸序列作为一个单位与数据库中已确定的B细胞表位比较，相似度越高得分越高，分值为0~1，为提高预测可信度，本研究只选取了分值不低于0.75预测结果。LEPS[9]是利用目标抗原一定长度范围氨基酸序列的物理化学性质二级结构、亲水性指数、表面可及性指数、柔韧性指数的参数大小，分别给予0.4、0.4、0.15、0.15的权重，并计算平均值，通过标准化法使最终分值为0~1，得到预测结果。
1.5 T细胞表位的预测应用在线预测软件SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)及IEDB(http://tools.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.html)提供的模块，预测主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ类)HLA-A0201限制性T细胞表位。SYFPEITHI使用的算法[10]是从目标抗原第一个氨基酸残基开始，以固定长度的氨基酸序列为一个单位(本研究选用9个)，计算每个单位氨基酸残基评分的总和，并依据评分总和排序；IEDB软件会根据目标序列的特点自动选择最优算法。
2 结果2.1 细粒棘球绦虫Eg18氨基酸序列使用Primer Premier 5.0软件推导出细粒棘球绦虫Eg18基因共编码160个氨基酸：kes dla dmk nka say esk iae lem llq qer har esl qks qdk lae mnr klk eet aas aee rnr lma qrd evq rev eaq kva mak kea eka qae ael rrm rek had khk sqv ngs gda asq dde sea kel evi pnv rrt ees rvt avs kne tlq tkl anl k。
2.2 理化性质预测结果利用Expasy系统的pr-otparam数据库预测Eg18分子量为18218.3 kDa，pI=6.07，280 nm处水中消光系数为1 490 L/mol cm，半衰期为3 h(哺乳类)、3 min(酵母菌)、3 min(大肠埃希氏菌)，不稳定指数为47.22(为不稳定蛋白)，亲水性指数为65.44。
2.3 二、三级结构的预测结果(图 1、2)图 1图 1 Eg18抗原二级结构 图 2图 2 Predict Protein软件预测的Eg18抗原三级结构通过Predict Protein软件预测Eg18抗原二级结构，发现Eg18抗原α-螺旋结构占氨基酸残基总数的98.1%，无规则卷曲占1.9%，无β-折叠结构(见图 1)。二级结构经折叠形成三级结构(见图 2)。
2.4 B细胞表位的预测结果(表 1) 表 1 表 1 ABCpred软件预测B细胞表位 表 1 ABCpred软件预测B细胞表位利用在线预测软件ABCpred预测得到分数较高的7个可能形成Eg18抗原B细胞表位的氨基酸序列区域(见表 1)；利用LEPS软件，得到可能形成Eg18抗原B细胞表位的氨基酸序列区域为：30~41、54~61、83~87、105~112、116~126、134~140。综合两个软件，筛选出两个软件推测的氨基酸序列区域相互重叠部分，得到4个氨基酸序列区域30~41、55~71、110~126、136~144，可能为Eg18抗原的B细胞表位。
2.5 T细胞表位的预测结果(表 2) 表 2 表 2 SYFPEITHI软件和IEDB软件分析T细胞抗原表位 表 2 SYFPEITHI软件和IEDB软件分析T细胞抗原表位利用在线预测软件SYFPEITHI、IEDB，根据每个氨基酸残基形成T细胞表位可能性并打分，分别选取分值较高的10个可能形成T细胞抗原表位的氨基酸序列区域，综合两个软件，筛选出两个软件推测的氨基酸序列区域相互重叠部分，得出17~27、32~41、61~72、96~105四个可能形成Eg18抗原T细胞表位的区域。
3 讨论棘球蚴18kDa抗原首先由Ito等[11]从泡球蚴原头节中发现，随后的研究发现细粒棘球蚴原头节中也有18 kDa抗原的存在。Jiang等[12]经同源性比较多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫发现核苷酸序列只有8个核苷酸不相同，但通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)和蛋白印迹(Western blot，WB)技术比较细粒棘球蚴病人与多房泡球蚴病人对于经纯化的重组Em18抗原反应发现，细粒棘球蚴病人的反应弱于多房泡球蚴病人，这可能是它们的空间结构存在差异。Li等[13]利用ELISA技术检测了246名细粒棘球蚴病人和173名多房泡球蚴病人血清IgG抗体对于重组Em18抗原的反应原性，发现28.9%的细粒棘球蚴病人为阳性，王永顺等[14]通过重组克隆技术获得重组Eg18抗原，检测细粒棘球蚴病人和多房泡球蚴病人血清IgG抗体，细粒棘球蚴病人和多房泡球蚴病人血清反应存在交叉，认为Em18和Eg18可能为同一种抗原。本研究发现Eg18抗原二级结构中α-螺旋结构占氨基酸残基总数的98.1%，无规则卷曲占1.9%，无β-折叠结构。通过软件选出具有优势的30~41、55~71、110~126、136~144四个可能为细粒棘球蚴Eg18抗原B细胞表位区域。B细胞表位一般存在于天然抗原分子表面，那些由序列上相连或不相连、但在空间结构上相互临近的氨基酸或多糖构成的表位，称为构象表位。此类表位大小不一，约由5~15个氨基酸残基或者5~7个糖基或核苷酸组成。不经加工处理即可直接被B细胞识别；α-螺旋键能较高，形态牢定，通常处于蛋白内部，于抗体接触机会少[15]，细粒棘球蚴Eg18抗原α-螺旋结构占氨基酸残基总数的98.1%，因此认为Eg18抗原形成B细胞抗原表位的可能是构象表位，这与预测结果一致。由于有外膜的存在细粒棘球蚴抗原不易释放到机体外，这可能是导致在ELISA检测中反应没有泡球蚴明显的原因。T细胞表位主要包括细胞毒性T细胞表位(cytotoxic T cell, CTL)和辅助T细胞(helper T cell, Th)表位，其中MHC-Ⅰ类分子主要识别CTL表位[16]，识别的抗原肽通常为8~11个氨基酸，常见为9个。T细胞抗原表位为线性表位，需经过抗原提呈细胞的处理，方能被T细胞受体识别，而Eg18抗原二级结构中α-螺旋为主，也为形成T细胞抗原提供了可能，本研究表位利用SYFPEITHI、IEDB软件, 选择两者结果重叠部分，得出17~27、32~41、61~72、96~105四个较有可能形成T抗原表位区域，这同样与预测结果一致。总之通过利用在线预测软件，获得可能的Eg18的B细胞抗原表位4个，可能为构象表位，T细胞表位4个，可为研究Eg18抗原提供一定的参考。