样品实验方案
简要概述
1.用测试化合物（200μL/样品）制备细胞2.加入APC-膜联蛋白V测定溶液3.在室温下孵育20-60分钟4.使用FL4通道的流式细胞仪分析细胞（Ex / Em = 635/660 nm）
储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。1. APC-Annexin V原液（100X）：将含有0.2％BSA的200μLPBS加入到APC-膜联蛋白V缀合物（组分A）的小瓶中并充分混合以制备100X APC-膜联蛋白V储备溶液。 注意：将重构的100X APC-Annexin V储备溶液储存在4 ℃。有关细胞样品制备的指南，请点击查看。
操作步骤
1.用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。注意：膜粘附细胞的膜联蛋白V流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。
2.离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
3.将细胞重悬于200μL测定缓冲液（组分B）中。
4.向细胞中加入2μL100XAPC-膜联蛋白V原液。
5.可选：将2μL100X碘化丙啶（组分C）加入细胞中，用于坏死细胞。
6.在室温下孵育20至60分钟，避光。
7.可选：在使用流式细胞仪分析细胞之前，添加200至300μL的测定缓冲液（组分B）以增加体积。
8.使用具有FL4通道的流式细胞仪（Ex / Em = 635 / 660nm）监测APC-膜联蛋白V的荧光强度。当碘化丙啶加入细胞时，使用FL2通道测量细胞活力。
数据分析
在活的非凋亡细胞中，APC-膜联蛋白V检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其通常为所有细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，APC-膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的外叶上，因此导致染色强度增加。
图1.使用Cell Meter APC-膜联蛋白V结合细胞凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞中APC-膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸的结合活性。 将Jurkat细胞在37℃，5％CO2培养箱中在没有（蓝色）或1μM星形孢菌素（红色）的情况下处理约4小时，然后用APC-膜联蛋白V染色30分钟。 使用FL4通道，用FACSCalibur（Becton Dickinson）流式细胞仪测量APC-膜联蛋白V的荧光强度。
参考文献
ALDH1 Bio-activates Nifuroxazide to Eradicate ALDHHigh Melanoma-Initiating CellsAuthors: Sana Sarvi, Richard Crispin, Yuting Lu, Lifan Zeng, Thomas D Hurley, Douglas R Houston, Alex von Kriegsheim, Che-Hong Chen, Daria Mochly-Rosen, Marco RanzaniJournal: Cell Chemical Biology (2018)
CHIP functions as an oncogene by promoting colorectal cancer metastasis via activation of MAPK and AKT signaling and suppression of E-cadherinAuthors: Jingjing Xu, Jun Zhou, Hanjue Dai, Fei Liu, Wenjing Li, Wenjuan Wang, Feng GuoJournal: Journal of Translational Medicine (2018): 169
Ubiquitin ligase CHIP functions as an oncogene and activates the AKT signaling pathway in prostate cancerAuthors: Li Cheng, Jin Zang, Han-Jue Dai, Feng Li, Feng GuoJournal: International journal of oncology (2018)
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