在酶学水平上对小分子抑制剂进行生物活性的定量测定相信是很多药物化学、化学生物学和生物学专业的同行们经常会遇到的问题。这个问题说难其实也不难，实验操作一般很简单，得到结果很容易；然而说简单也不尽然，比如很多人未必对于题目当中列出的IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff等概念都分得清，实验背后涉及到的米氏方程适用范围
在解释之前先放一张酶学反应式的图，方便后文的说明：
注：E=enzyme; S=substrate;ES=transition state complex of E and S; P=product; I，I’=inhibitor;EI,EI’=complex of enzyme and inhibitor; kx=corresponding reactionrate constant； [X]=concentration of X
一、 定义
1） IC50(half maximal inhibitory concentration)
EC50(half maximal effective concentration)
广义的讲，IC50是对指定的生物过程（或该过程中的某个组分比如酶、受体、细胞等）抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。药学中用于表征拮抗剂（antagonist）在体外实验（in vitro）中的拮抗能力。EC50是指在特定暴露时间后，能达到50%最大生物效应对应的药物、抗体或者毒素等的浓度。药学中除了用于表征体外实验中（in vitro）激动剂（agonist）的激活能力外，还可用于表示达到体内（in vivo）最大生物效应一半时所需的血药浓度。在很多文献中，EC50也用于表征某化合物在细胞水平的效力(包括激动和拮抗)
2） Ki
抑制常数（inhibition constant），反映的是抑制剂对靶标的抑制强度，这个值越小说明抑制能力越强，某些情况下可以与后文的Kd等同。
Ki为50%的酶E被抑制剂I结合时对应的游离抑制剂的浓度。
3） Kd
解离常数（dissociation constant），反映的是化合物对靶标的亲和力大小，值越小亲和力越强。
从此公式得出:Kd为50%的酶E被抑制剂I’结合时对应的游离抑制剂的浓度。
4） Ka
结合常数（association constant），与Kd相反，值越大亲和力越强。
5） Km
米氏常数（Michaelis-Menten constant）,为酶本身的一种特征参数，其物理意义为当酶促反应达到最大反应速度一半时底物S的浓度。Km的大小只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关，但是随着测定的底物不同、温度、离子强度和pH的不同而不同。
只有当k2>>k3时，Km才近似等于ES的解离常数（Kd）。
6） Kon
结合速率常数（association rate constant），代表分子间结合时的快慢，单位为M-1∙S-1,与结合常数Ka (association constant)一词之差，差别却很大。
7） Koff
解离速率常数（dissociation rate constant），代表分子间解离时的快慢，单位为S-1,与解离常数Kd (dissociation constant)一词之差，差别却很大。【注：在SPR实验中，Kon和Koff 通常是以Ka和Kd给出的，而算出来的Kd和Ka它们又通常用KD和KA表示，注意这只是它们软件自己的标注方法，千万不要与标准的定义搞混了。个人觉得正是它们这种随便自己命名常数表示形式的做法，才导致很多小伙伴们看到这些概念时越来越混淆，害人不浅】
二、 区别
1） IC50和EC50
前面的定义部分其实已经说的很明白了，这里简单总结下使用范围：
IC50:只表征体外（in vitro）实验中拮抗剂（antagonist）的效力，但一般不包括细胞水平的数据表征。
EC50:可表示体外（in vitro）或体内（in vivo）数据：体外数据一般是细胞水平激动或者拮抗表征，以及激动剂的酶学水平数据表征；体内数据一般是动物水平。
2） IC50和Ki
从定义上能很明显地看出两者的区别，虽然两者都是表征化合物对靶标亲和力的指标，但是IC50与实验中所用酶的浓度、底物浓度都有关，而Ki是不受这些变量的影响的。目前很多药物化学文献中都不标注自己酶活实验所用酶和底物的浓度，直接给出IC50数据，其实这不利于不同文献之间化合物抑制能力的比较，因为IC50大小是可以通过酶和底物浓度进行调节的。从这个角度上来说，Ki才是更加准确的衡量指标，但是为何大多数文献都不用呢？这主要是由于Ki的测定过程稍繁琐。我们知道IC50的测定只需要拉出抑制剂浓度梯度进行生长曲线拟合即可方便地得出。然而Ki的测定需要先测定该酶特定条件下的Km，然后在某种抑制剂浓度、不同底物浓度下进行双倒数作图，得到表观Km(即Kmapp)后再根据Kmapp=Km(1+[I]/Ki)得到Ki,不过在竞争性抑制剂情况下，固定酶的浓度，IC50与Ki满足Cheng-Prusoff方程[3](注：此方程不适用于tight-binding型抑制剂，对于这种抑制剂其IC50与酶浓度相关)：
也需要预先知道酶的Km值。
3） Ki和Kd、Km
先说Ki和Kd：
前面提到过Ki和Kd在某些情况下是等同的。使用范围上：除了一些激动剂我们不用Ki表示其亲和力外（一般用Kd），拮抗剂用Ki和Kd表示其对靶标的亲和力均可。但是只有当无其他物质与该抑制剂进行竞争性结合时我们才能将Ki与Kd划等号。很容易发现，我们前面提到过的Ki都是在有底物S存在条件下进行竞争性生化实验测得的，而Kd都是单独的抑制剂与靶标蛋白结合过程测定的，两者的表达式都是：
可见唯一不同的就是Ki测定时多了底物的竞争，而根据Ki定义，总酶量一定时，若想达到50%的酶E被抑制剂I结合，必定比无底物S竞争时需要的总抑制剂I