食味品质改良是提高稻米商品价值的重要途径[1, 2, 3]。水稻胚乳中的直链淀粉含量与食味品质关系密切, 直链淀粉含量高, 米饭黏性小、硬度大、蓬松干燥, 适口性差[4, 5, 6]。调控直链淀粉含量的主效基因为蜡质基因Wx[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15], 该基因座上存在多个复等位基因[11, 13, 16], wx存在于糯稻中; Wxa多存在于籼稻中, 含有该基因的水稻品种直链淀粉含量普遍偏高, 约为20%~28%; Wxb主要存在于粳稻中, 直链淀粉含量对应为15%~19%; 其他几种复等位基因如Wxin、Wxmw、Wxmq、Wxop、Wxmp等则存在于特定品种中并导致直链淀粉含量不同程度的降低[11, 13, 16]。利用上述低直链淀粉基因进行稻米品质改良, 已取得了显著成效[2, 9, 11, 13, 14, 15, 16]。
目前, 上述Wx复等位基因的序列差异都已明确。Wx基因座第1内含子+1位G-T的SNP (下称SNP1)多态性形成了Wxa及Wxb两种基因型[14, 15], 蔡秀玲等[15, 17]通过设计酶切引物PCR-AccI来区分相应的基因型。Wxa基因型材料中第6内含子1132 bp处A-C的SNP多态性(下称SNP2)形成了Wxin基因[11], Wxb基因型同样位点的SNP突变被命名为Wxmw基因[13]; 倪晖[13]通过设计2对STS标记并结合酶切标记PCR-AccI对上述基因型实现鉴定。然而, 这些标记的检测方法具有费用昂贵、操作复杂、耗时较长等缺点, 不适合MAS工作中大量材料的筛选。
Tetra-primer ARMS-PCR是近年来建立在普通PCR和ARMS-PCR基础之上开发的一种专用于检测单核苷酸突变的衍生技术[18, 19, 20], 是一种共显性标记, 由于其操作简便, 耗费较低, 被广泛应用在医学、动植物等领域SNP的多态性检测[19, 20, 21]。Tetra-primer ARMS-PCR类型引物扩增过程中, 由于4条引物存在于同一PCR体系中, 经常出现扩增效率低及非匹配的延伸情况, 降低了检测的准确性[18, 19]。Ye等[19]提出通过严格控制退火温度来增强检测的准确性, 但该方案仅适合于4条引物的解链温度差异较小的情况。在4条引物的解链温度差异较大状态下, 其引物设计策略及扩增条件尚需进一步探索。