细菌生存所处的微环境是动态变化的，表观遗传对基因表达的调控可以帮助细菌更好地适应多变的生存环境。比如对于一些致病菌来说，应对宿主免疫反应的能力对它们在宿主中的生存和繁殖至关重要，而表观调控在某种程度上帮助细菌加强了这种能力。表观遗传不同于传统的用基因序列承载和传递遗传信息的方式，是以不改变基因序列的方式传递遗传信息，从而调控基因表达。表观遗传的机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA沉默[1]。在真核生物中，表观遗传的研究主要集中在胚胎形成、细胞分化以及癌症的发生，其中癌症的发生与基因的错误表达或沉默有关[1]。在原核生物中，表观遗传的研究主要集中在DNA甲基化参与的胞内生理过程，包括DNA复制起始、错配修复和调控基因表达等。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶将甲基基团从腺苷甲硫氨酸转移至腺嘌呤或胞嘧啶形成6-甲基腺嘌呤(6-Methyladenine，6mA)，4-甲基胞嘧啶(4-Methylcytosine，4mC)和5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine，5mC) 3种修饰，其中5-甲基胞嘧啶主要存在于真核细胞中，而6-甲基腺嘌呤甲基化和4-甲基胞嘧啶甲基化主要存在于原核生物中。
早期对细菌甲基转移酶的研究集中在它与限制性内切酶的关系和生理意义，因为它们可以形成一种修饰限制系统(Restriction-modification，R-M)，帮助细菌抵抗噬菌体等外源DNA的入侵[2]。然而，在某些微生物中，限制性内切酶并没有伴随甲基转移酶一起出现，这种甲基转移酶被称作孤儿甲基转移酶(Orphan methyltransferase)。孤儿甲基转移酶包括DNA腺嘌呤甲基转移酶(DNA adenine methyltransferase，Dam)，细胞周期调控甲基转移酶(Cell cycle-regulated methyltransferase，CcrM)和DNA胞嘧啶甲基转移酶(DNA cytosine methyltransferase，Dcm)，孤儿甲基转移酶可以参与重要的细胞生理过程，包括DNA复制起始、DNA错配修复和调节基因表达等(图 1)，但是至今为止还没有出现关于Dcm参与原核生物表观遗传调控的相关报导。
图 1 细菌中DNA甲基化参与调节的主要细胞生理过程 Figure 1 Overview of the cellular physiological processes regulated by DNA methylation in bacteria. 图选项为了满足深入研究甲基化修饰及其表观遗传机制的需要，甲基化修饰的相关检测技术正在不断地更新和进步。基于第二代测序技术如Illumina测序的甲基化修饰检测需要对待测DNA进行预处理，例如胞嘧啶甲基化的检测运用重亚硫酸盐法[3-4]：DNA上没有被甲基化修饰的胞嘧啶被重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶，PCR时尿嘧啶会被读作胸腺嘧啶而被甲基化的位点不变；腺嘌呤甲基化的检测运用限制性内切酶酶切的方法，比如DpnⅡ切割未甲基化的GATC而MboⅠ切割甲基化的GATC位点[5]。但是这些方法由于预处理的误差及相对短的测序读长使得对基因组全局修饰的描绘进展艰难。近年来，单分子实时(Single molecule real-time，SMRT)测序技术的发展和应用突破了这种局限，使得描绘整个基因组的甲基化图谱成为可能[6-8]。SMRT测序技术是基于边合成边测序的方法，在纳米微孔中以基因组片段为模板进行扩增，带有不同荧光标签的脱氧核苷酸dNTP在被加入新生链时会被激发出荧光，通过捕获和分析这些荧光的信息可以得出DNA的序列[6-8]。SMRT测序技术有比第一代和第二代测序技术更长的读长，有利于后续的组装和获得较为完整的基因组信息。由于第三代测序技术是单分子实时测序，样品DNA不需要进行预处理也不经过扩增直接测序，使得原始模板DNA上的核酸修饰信息也能表征在最终的测序信号中[6-8]：通过检测2次荧光出现的间隔可以分析出该核苷酸上的修饰类型。SMRT测序技术经过几年的迅速发展和成熟，已经帮助科研人员获得了大量的DNA序列信息，特别是为研究DNA甲基化修饰的修饰类型、修饰频率、修饰图谱等提供了更加广阔的发展空间(表 1)。
表 1. 细菌中甲基化酶的修饰类型和修饰序列[9] Table 1. Types and recognition motifs of DNA methylase in bacteria[9] Methylation type Recognition motifs Methylase name Organism name Biological function m5C CggccG Ama55Ⅰ Alicyclobacillus macrosporangiidus CPP55 R-M system ggCGcc BloAⅠ Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697 R-M system GatC CpeAⅢ Clostridium perfringens ATCC 13124 R-M system GgncC MjaⅡ Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 R-M system CcwgG SptADcm Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150 R-M system gCgcGc Nme18V Neisseria meningitidis serogroup C FAM18 R-M system m6A gATc EcoKDam Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Epigenetic regulation* gAnTc CcrM Caulobacter crescentus CB15 Epigenetic regulation* TtaA Asp24188Ⅰ Acidobacteriaceae bacterium TAA166 Not found cgAannnnnTga Pmi614Ⅰ Patulibacter minatonensis DSM 18081 R-M system gaAnnnnnnnnTcgc SptAⅢ Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150 R-M system m4C tgGCca Aco12261Ⅲ Aminobacterium colombiense DSM 12261 Not found GgncC CocⅢ Capnocytophaga ochracea DSM 7271 R-M system gCcnnnnngGc CagⅠ Chloroflexus aggregans DSM 9485 R-M system caGCtg Mru1279Ⅳ Meiothermus ruber DSM 1279 Not found CtaG Lba2029Ⅱ Lachnospiraceae bacterium AC2029 R-M system *Described in this review. 表选项 1 甲基化与DNA复制起始细菌通过基因组DNA的复制和细胞分裂保证自身的繁殖和遗传物质的传递，DNA甲基化在DNA的复制起始过程中扮演了重要的角色。在大肠杆菌中，当DnaA蛋白结合在oriC区域时可以启动基因组复制[10]。DNA复制后，大肠杆菌的基因组从完全甲基化(双链都被甲基化)变为半甲基化(模板链被甲基化而新生链没有被甲基化)，这时大部分半甲基化的GATC位点在2–4 s后被Dam完全甲基化[11]，但是oriC区域的11个GATC位点和dnaA的启动子区的8个GATC位点因为复制起始调节蛋白SeqA的结合而保持一段时间的半甲基化状态[12]，此时DnaA蛋白对oriC的结合也会阻止Dam对其甲基化，从而维持oriC的半甲基化状态[13]，SeqA对dnaA启动子区的结合可以抑制dnaA表达，保证了DNA不会再次启动复制[14]。在DNA处于半甲基化状态的这段时间内，细胞内的其他作用机制将使DndA失活，以保证细胞在分裂之前不会再次启动DNA复制[15]。
2 甲基化介导的错配修复DNA在复制过程中可能会引入错误的碱基导致错配，DNA的错配会改变遗传信息进而影响微生物的生长繁殖，所以细菌需要特定的机制来修复这种错配。在Dam甲基化介导的错配修复系统中，MutS识别错配的碱基，MutL与MutS相互作用并招募可以特异识别GATC位点的核酸内切酶MutH形成多蛋白复合物[16]。MutH于错配位点附近切割无甲基化修饰的新生链5′端鸟嘌呤的磷酸二酯键[17]。然后，核酸外切酶UvrD逐个降解该链上的碱基包括错配的碱基，最后由DNA聚合酶Ⅲ加上正确的碱基，DNA连接酶将缺口连合[18]。因此，Dam甲基转移酶的甲基化作用对维持细菌DNA的完整和正确性非常重要。值得一提的是，Dam甲基化的修饰基序GATC很短并且在基因组上分布广泛，使Dam甲基化依赖的配修复系统更灵活高效地行使功能。研究发现，甲基化介导的错配修复系统仅存在于含Dam甲基转移酶的大肠杆菌或其他γ变形菌，部分菌株的错配修复系统中不含有MutH[19]，但MutL高度保守的核酸内切酶活性可以替代MutH的切割作用[20]。
3 DNA甲基化参与基因表达调控 3.1 Dam甲基转移酶调控基因表达通常情况下，大肠杆菌的基因组处于完全甲基化状态，只有在基因组复制后的一瞬间是半甲基化状态。dam缺失突变株的自然突变率比野生型高，也失去了协调基因组复制起始的能力[21]，这说明甲基化可以参与DNA复制和修复[22]。那么甲基化是否参与基因表达调控呢？
Oshima等对大肠杆菌的dam缺失突变株进行了全局基因调控变化的研究，结果表明，与野生型相比，在dam缺失突变株中，一些与有氧呼吸、氨基酸代谢、核酸代谢、鞭毛合成、趋化性和SOS反应相关的基因表达量发生了变化[23]，但大部分基因的变化幅度较小(小于2倍)。也就是说，虽然大肠杆菌中有很多基因的启动子区都存在GATC位点，只有少部分在dam缺失突变株中有显著的表达量变化，所以Dam并不是一个全局调控因子[15]。但是，Dam可以调控大肠杆菌中特定基因的表达，如trpR[24]、Tn10转座子[25]、dnaA[26]等。研究者通过SMRT测序对不同生长阶段(稳定期、衰亡期、长期稳定期)的大肠杆菌基因组的GATC甲基化位点分布进行了研究，发现66个GATC位点的甲基化状态变化是和其他的位点明显不同的，其中有3个和唾液酸的转运和代谢有关，说明这些基因是受到dam甲基化调控的[27]。Dam甲基转移酶可以改变某些调节蛋白与DNA之间的相互作用[28]，比如，Dam通过改变GATC位点(通常是在启动子区的RNA聚合酶结合区)的甲基化状态来增强或抑制转录。上文所述的甲基化介导DNA复制就是一例。
霍乱弧菌有2条染色体，染色体Ⅰ (oriⅠ)的复制与大肠杆菌一样，需要DnaA起始、SeqA隔离来保证每次分裂只复制1次[29]，而染色体Ⅱ的复制和大肠杆菌不同，oriⅡ的复制起始需要Dam而不是SeqA的参与[29]。除了dam，在霍乱弧菌基因组还存在其他3个甲基转移酶vca0447、vc1769和vchM。Vca0447是一个孤儿腺嘌呤甲基转移酶；Vc1769是参与R-M系统的腺嘌呤甲基转移酶，与大肠杆菌的HsdM蛋白同源[30]；VchM是孤儿胞嘧啶甲基转移酶，可以将5′-RCCGGY-3′序列中第1个胞嘧啶甲基化[31]。全局基因调控分析表明在vchM突变株中79个基因的表达发生了显著性变化，包括氨基酸代谢、能量代谢和铁原子利用相关基因[30]。
3.2 CcrM甲基转移酶调控基因表达CcrM甲基转移酶初次发现于新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中，其基因组DNA甲基化位点为5′-GANTC-3′中第二位腺嘌呤。新月柄杆菌属于革兰氏阴性α变形菌，是研究细胞周期的模式菌株[32]。ccrM的转录受细胞周期调控，它只在细胞分裂前期也就是基因组复制后积累[33]。不同于Dam甲基化的是，CcrM甲基转移酶在DNA复制后不会立即将半甲基化的DNA甲基化，复制后和甲基化前的这段时间内，DNA结合蛋白会和DNA再结合[34]。ccrM调控基因表达的发现源于ccrM基因本身，ccrM启动子区GANTC位点的甲基化会抑制其自身的表达，突变了该位点后ccrM的转录就恢复了正常[35]。对新月柄杆菌基因组进行SMRT测序后发现，该菌基因组上有4542个甲基化的GANTC位点，其中23%是在基因间隔区，占基因组的9%，这些位于基因间隔区的甲基化位点极有可能参与了基因表达的调控[8]。研究发现，在柄杆菌整个细胞周期内有27个ccrM位点一直没有被甲基化，这些位点位于基因间隔区、编码区和一些关键基因的上游[8]。全基因组生物信息学分析表明，在受到ccrM基因调控的细菌中，位于基因间隔区的ccrM位点比较多，而处于基因内部的ccrM位点相对较少[36]。而且，许多基因的转录受到其启动子区的ccrM甲基化状态的调控。在柄杆菌的3932个基因中，388个基因的表达在ccrM的突变株中出现了显著性变化，而在这388个基因中，80个基因的启动子区含有GANTC位点[36]。根据以上信息，可以推测启动子区ccrM位点的甲基化状态有可能通过参与DNA与蛋白质的互作来调控基因的表达。
GcrA是新月柄杆菌中部分基因的调控因子。研究表明，GcrA结合序列的GANTC位点含量是普通序列含量的3倍[37]，GcrA可以与161个启动子结合，其中89个启动子含有至少一个GANTC位点[37]。后来研究这些启动子区含有GANTC位点基因的表达量时发现，缺失gcrA或突变GANTC位点都会使表达量下降。然而，虽然GcrA可以结合含有GANTC的启动子，但只有特定一部分含有GANTC的启动子可以通过与RNA聚合酶相互作用被激活[37]。Haakonsen等发现，GcrA几乎可以与所有启动子区结合，不论这些区域有没有甲基化位点[38]。一些细胞循环调控基因的启动子在–35和–10区以外含有GANTC甲基化位点，这样的基因在细胞周期GcrA活性最强的时候表达量却非常小[39]。综上所述，GcrA是基于甲基化的转录调控因子，因此也是细菌中为数不多的表观调控因子之一。
4 DNA甲基化与细菌致病性DNA胞嘧啶甲基化在致病菌致病性相关基因表达方面也发挥了调控作用。DNA甲基化对细菌毒性的影响首先在鼠伤寒沙门氏菌(S. enterica serovar Typhimurium)中发现，敲除dam以后，该菌对小鼠的侵染效率明显降低。沙门氏菌的dam缺失突变株表现出多方面的致病性缺陷，包括膜不稳定性、蛋白外泌、移动性下降和囊泡外排，而且对深层组织的侵入能力下降[40]。在变异链球菌(Streptococcus mutans)的研究中作者发现，dam的突变会影响致龋性相关基因的表达[41]。沙门氏菌dam缺失突变株致病性的降低可能是由于致病性相关基因表达调控异常，使得在感染过程中需要增加表达量的基因没有得到正确的调控而影响致病性，比如spvB，一种可以导致巨噬细胞凋亡的细胞毒素[42]。另外，dam的过量表达也可以对致病菌的致病性造成影响，在过量表达Dam的假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)中，一些可以抑制吞噬作用和感染因子的蛋白分泌增加，减弱其致病性[43]。研究表明，CcrM的过量表达会抑制布氏杆菌在巨噬细胞中的生长繁殖，这可能由于CcrM的过量表达影响了一些适应宿主环境必需基因的表达。
5 甲基化与相变异相变异是一个控制基因表达开启或关闭的开关，可以改变一个或多个蛋白在不同细胞里的表达量[44]。细菌中有很多相变异机制，比如滑链错配[45]、位点特异性重组[46]和DNA甲基化[47]。前两者需要改变基因序列，而DNA甲基化不依赖基因序列的改变，因此是一种表观调控。根据目前的研究基础，大肠杆菌中Pap相变异和Ag43相变异的调控机制已经较为清晰。Pap是肾盂肾炎相关菌毛基因[48]，Dam甲基转移酶参与了Pap的相变异调控机制，使得大肠杆菌产生不同的群体，有的有Pap菌毛(开启状态)有的没有(关闭状态)。Pap操纵子的启动子区含有6个亮氨酸应答调控蛋白(Leucine-responsive regulatory protein，Lrp)结合位点。位点1–3位于papB基因上游，并且在位点2处有1个GATC位点(GATC-2)；位点4–6位于位点1–3的上游，并且在位点5处有1个GATC位点(GATC-1)[48]。在pap处于关闭状态时，GATC-2在2条链上都没有被甲基化，而GATC-1在两条链上都有甲基化，由于Lrp趋向于结合没有甲基化的位点，所以结合在位点1–3以维持关闭状态。当基因组启动复制时，Lrp从位点1–3上脱离，复制完成时，位点1–3变为半甲基化状态，此时PapI蛋白会帮助Lrp结合至位点4–6使pap操纵子变为启动状态[49]。ag43编码外膜蛋白Ag43，它所具有的自聚集能力可以加强生物膜的形成，也可能会影响噬菌体的吸附[50]。ag43的表达取决于一段序列上3个Dam位点的甲基化状态，这段序列与氧化压力反应蛋白(Oxidative stress response protein，OxyR)结合区重合。OxyR是ag43表达的负调控因子，GATC位点的甲基化使得OxyR不能与之结合，所以ag43的表达呈开启状态；在没有甲基化的情况下，OxyR结合至调控区，致使ag43的表达变为关闭状态[51]。近期研究发现，在沙门氏菌中，opvAB操纵子产生的2个蛋白OpvA和OpvB可以改变脂多糖上O抗原的长度[52-53]。opvAB操纵子的表达通过相变异机制调控，需要Dam甲基转移酶和OxyR参与[52-53]。相变异是DNA甲基化参与调控特定基因表达的有力证据，其调控机制的揭示为甲基化调控胞内生理过程的研究提供了佐证并指明了方向。
6 总结与展望DNA甲基化修饰通过对胞嘧啶或腺嘌呤进行修饰，不仅构成了细菌限制修饰的免疫系统来帮助细菌调节自身对外来DNA的反应，还可以在不改变基因序列的前提下对一些基因的表达进行表观调控，增加了细菌的遗传多样性，是细菌繁衍和进化过程中极为重要的一部分。大肠杆菌Dam甲基转移酶在整个细胞周期都表达，使其DNA处于完全甲基化状态，但在基因组复制时可以在启动子区产生短时的半甲基化状态，DNA甲基化状态的不同可以改变DNA与蛋白的结合能力从而调控基因的表达。DNA与蛋白的结合会抑制甲基化酶在该位点的甲基化，比如OxyR、Lrp，因而产生稳定的半甲基化和无甲基化位点。新月柄杆菌中的CcrM甲基转移酶只在细胞周期内很短一段时间表达，在基因组复制的过程中启动子区处于半甲基化状态的时间稍长于大肠杆菌。相变异也是表观遗传中重要的调节机制，细菌通过改变操纵子上游GATC位点甲基化状态来调控操纵子的表达，相变异可以帮助细菌更好地适应宿主环境和应对免疫反应。DNA甲基化有助于理解细菌基因组的三维空间结构和空间结构上远距离的基因蛋白相互作用：基因组结构捕获(Chromosome conformation capture，3C)[54]及其衍生技术是基因组三维结构相关研究的重要手段，在这种技术中，首先需要将细胞进行预处理使DNA的结构固定，然后提取DNA，再依次进行核酸酶处理、连接酶连接、测序等步骤，最终得到胞内远距离相互作用的DNA序列，对测序结果进行分析后可以描绘出整个基因组的三维结构。基因组三维结构形成的主要原因之一是DNA与蛋白之间频繁的相互作用，由于DNA甲基化的状态会影响其与蛋白之间的相互作用，对基因组三维结构进行分析时如果将DNA甲基化对DNA蛋白相互作用的影响考虑在内，将会有助于剖析高分辨率的基因组三维结构。DNA磷硫酰化修饰是一种新型的DNA骨架生理修饰[55]，像DNA甲基化一样，DNA磷硫酰化修饰也是一种限制-修饰系统[56]。但是参与DNA磷硫酰化修饰的蛋白DndABCDE比甲基化的多，机制更加复杂，因此研究进展艰难。根据最新的研究，DNA甲基化和DNA磷硫酰化修饰两种修饰系统能够相互兼容，其修饰基因能够识别同一序列，形成杂合修饰d(GPS6mA)结构；而两者的限制系统同时都会受到两种修饰系统的制约[57]。由此可知，DNA甲基化的研究对DNA磷硫酰化修饰的进一步探索有不可替代的推动作用。
但是关于细菌的表观遗传，还有很多难题亟待解决。比如，虽然基因组上大部分的甲基转移酶识别位点都被甲基化了，但是仍有一些位点逃过了甲基转移酶的甲基化，其机制是什么？有与之相互作用的蛋白和甲基转移酶相互竞争，还是可以形成特定的二级结构？不被甲基化的位点是否还有其他功能？CcrM甲基转移酶是否有维持基因组结构的功能？甲基化与致病菌毒性的关系还只停留在表型层面，其机制尚未研究清楚。4-胞嘧啶甲基化也在细菌中广泛分布，胞嘧啶甲基化是否具有除限制-修饰系统以外的功能？由此可见，对细菌表观遗传的研究仍处于初级阶段，未来充满了挑战，但相信所有问题的答案都可以在今后的研究中一一被揭示。