今天又在做Western，准备蛋白样品的时候遇到一个问题，于是向老师请教，结果被骂得狗血淋头。* 被骂不要紧，今天终于发现了我在蛋白样本制备和保存中存在一个一贯错误。
我曾经拍过一集《实验员小哈&实验系列 - 第八集 - 贴壁活细胞全蛋白提取》（https://www.bilibili.com/video/BV11f4y1R7R4），视频中，蛋白提取完毕后，我按照1:4的体积比加入buffer对蛋白进行100度5min的煮样，然后-80度冻存，以备之后做western blot。
多少年了，我一直是这么做的，也没发生什么问题。
但是！今天我尝试从组织中提取蛋白，参考之前从细胞中提蛋白的方法，加了一个匀浆的步骤，一路做到离心、取上清、定量。至此，一切都很顺利，除了所得蛋白液不是无色的，略带一点黄褐色，让我有一丝丝担忧。但因为定量结果显示蛋白浓度很高（大于10mg/ml），我也就没有太在意。
加buffer，煮样，悲剧了。煮样5min以后，蛋白液不再是澄清的液体，蛋白凝固沉淀了。拿去问老师，被骂了。。。
先说蛋白为什么凝固沉淀了。因为我今天制备的样品，不但浓度高，体积也大，于是蛋白的总量很大。按之前较低量蛋白的算法，加入的buffer不够。
-- 那我可不可以多加一点呢？
-- 不可以！
-- 那现在怎么办呢？
-- 扔掉，重新做！
正确的做法：蛋白提好了，定量做完了，就什么也不要干了！量大的话，分装冻起来，等到要做Western的时候，再取适量出来解冻、加buffer、煮样、Western。
-- 被骂了也不忘诡辩：以前从细胞里提蛋白，提不了多少，Western也不够做几次的，提前煮样冻起来，做Western的时候，就少了个步骤，能快一点做完下班。。。
祈祷下一轮组织蛋白的提取顺利～～