2023-01-07 星期一 晴1、周末答应了三个病人导诊。结果只来一个病人，给他安排了住院。其中一个病人直接爽约，另外一个病人临了给我打电话说没来了，我猜可可能是去了别的医院。2、接着去细胞房关心细胞大哥。140细胞依旧不堪入目，黑色的点点逐日增加，严重影响了细胞的生长。将其拍摄下来，与同门商讨策略，据悉，给我细胞的师弟，他后来的细胞也污染得一塌糊涂。所以，我准备让师弟再邮寄细胞给我，重新来过。另外，510细胞今日也出现少许黑色的点点，希望不要在增加了。（上天保佑）3、与YB公司电话联系，确认het-1a细胞成功下单，希望这周细胞就能够顺利抵达。4、ZB兄弟告诉我，他昨天使用研钵地提取了组织RNA，而且浓度和纯度都达标了，真是可喜可贺啊，我虚心地向他求教了个中的经验。说实话，这位小兄弟挺厉害的，他不仅动手能力强，而且善于思考，将来一定大有前途！5、中午吃饭的时候，和病理科的医生探讨了病理切片的事宜，随后决定先切50片的标本先行预实验，摸索抗体浓度、操作流程等。更欣慰的是，订购的50片的载玻片和目标抗体也相继送达了。6、午饭过后，我开始细胞实验，把仅存的140细胞也复苏了。这次更换了新的1640、FBS、PBS、胰酶，这次如果在出现黑点点，只能说明细胞从头就污染了。细胞传代时的胰酶消化时间，以及传代比例还有待进一步摸索、改进。7、按照既定的westernblot学习计划，准备开始实验操作。我把污染相对较轻的140细胞消化下来，用以提取总蛋白。同样510细胞也留取了2管用以提蛋白。
细胞总蛋白的提取:1.倒掉培养液，PBS洗两遍。2.每瓶细胞加1ml 胰酶消化细胞，2-3分钟，待细胞变圆，细胞间隙变大，震荡细胞可漂浮，加入2ml培养基终止消化，离心，弃上清。加入1mlPBS洗涤细胞，然后转移至EP管，离心，弃上清。3、配置RIPA裂解液：按1ml裂解液加10μl 的PMSF（100mM），离心、摇匀置于冰上。4.每个EP管加150μl含PMSF的裂解液，冰上裂解15min，为使细胞充分裂解。5.于4℃下12000rpm离心15min。(提前开离心机预冷)6.将离心后的上清分装转移到1.5ml的离心管中放于-20℃保存。
8、随后开始BCA蛋白浓度测定。
BCA蛋白浓度测定：1、稀释BSA标准品以制作标准曲线：取8支EP管，每管加30ulPBS，第一管加30ulBSA，混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白（即本底值）。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。2、【忘记稀释了】5倍稀释样品蛋白：取3支EP管（3个样品），各管加40ul RIPA，再分别取10ul样品在各管中稀释3、将8个标准品和稀释待测样品各加25ul于96孔板中。4、配制BCA工作液：每个样品做2个重复（第一次做，未做2个重复），再加上8个标准品，一共14个孔，按16个孔算，以防加样损失。则需A液：200ul×16=3200ul，B液：4400ul/50=88ul，计算好所需体积后在一干净试管中将A、B工作液混匀。5、混匀后立即向各孔中加入200ul配制的BCA工作液，振荡30min，37℃孵育30min。6、酶标仪562nm下测定各样品和BSA标准品的吸光度值，作出标准曲线，计算出待测样品的浓度。【由于未稀释，结果浓度太高远离标准曲线范围，机器未能给出读数】7、根据各样品浓度计算1×loading buffer体积，将各样品浓度调为一致；并计算5×loading buffer的体积，加入各管中。混匀后沸水煮15min，冰上分装，存于-20℃。
8、已经预约了明天的WB，希望顺利。