内参的选择
在western blot（WB）实验中内参蛋白是非常重要且必须的一部分，内参蛋白通常是由细胞中管家基因编码的蛋白，内参保证了每个泳道中蛋白上样量相同，不同泳道上的蛋白以相同的效率从凝胶转到膜上，不同泳道上抗体孵育（包括一抗和二抗）、信号检测都是一致的，是量化目的蛋白相对表达量的重要标尺。
插叙：前期我们有推送过蛋白印迹相关SCI期刊提出的要求（点击下文阅读）APS一区期刊:蛋白印迹杂志社要求的整膜、未裁剪的膜长什么样2023-12-12 该SCI期刊强调：对于WB等结果的严格要求2023-12-051. 理想的内参蛋白需满足的条件
理想的内参蛋白应满足以下条件：
（1）高度或中度表达，排除太高或低表达；
（2）在测试条件下内参蛋白水平要保持恒定（与总蛋白量相比），例如，用特定药物处理或未经特定药物处理、正常细胞和癌细胞、细胞周期以及细胞是否活化、内源性或外源性因素等；
（3）内参蛋白和目的蛋白相对分子量有差异，内参和目标蛋白的检测限都在动态范围内，可在信号不饱和的情况下揭示内参和目标蛋白量的变化。
2. 哺乳动物细胞中常用的内参
全细胞或细胞浆中：GAPDH、β-Actin、β-Tubulin、Vinculin等；
细胞核中：Lamin B1、TBP、HDAC、PCNA、Histone H3等；
线粒体中：HSP60、COX IV等。
（1） GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在糖酵解过程中将3-磷酸甘油醛进一步磷酸化的一个酶，其编码基因属于管家基因，广泛表达于各种细胞组织中，且表达相对稳定，故常常用来作为western blot的内参。GAPDH会随着组织老化，表达水平发生变化，因此不适合在年龄差别很大的组织样本中作上样内参；缺氧时GAPDH聚集，表达上调，因此不能在涉及氧气的相关研究中作为内参；此外，GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，故在研究肿瘤代谢过程时应慎用。
（2） β-Actin：β肌动蛋白，一种非肌型肌动蛋白，也是一类常见的管家基因编码的蛋白质，主要功能是组成细胞的骨架。在各种组织中广泛表达，表达水平相对恒定。但在胞质分裂、内吞或应激等进程中，细胞骨架重组信号刺激纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚；在原发性乳腺癌细胞中，肌动蛋白被高度磷酸化；在凋亡条件下，心肌和骨骼肌中均能观察到β-Actin的清除，因此，在相关研究中需要谨慎选择。
（3） β-Tubulin：是Tubulin（微管蛋白）家族中的一员，微管蛋白在物种间高度保守，不同亚型的微管蛋白也有显著的同源性。β-Tubulin是一类重要的管家基因编码的蛋白，在细胞周期过程中扮演重要角色，广泛用于作为WB内参。微管蛋白是多种药物的作用靶点，如抗癌药物紫杉醇、长春碱和长春新碱，抗痛风药物秋水仙碱和抗真菌药物灰黄霉素，因此有这些药物作用时，内参勿选Tubulin。
（4） Lamin B1：核纤层蛋白B1，核纤层蛋白是一种核膜结构组分，用于支撑核被膜并参与细胞周期中核被膜的解体和再形成，对维持正常的细胞功能（如细胞周期控制、DNA复制）非常重要。Lamin B1在物种间高度保守，常用于有核被膜的样品作为内参。在细胞凋亡时，Lamin B1可被caspase剪切，另外，核纤层细胞B1基因LMNB1的复制与神经系统疾病，成年期发病脑白质营养不良的发病机制相关，在相关研究中应予以注意。
总之，选择内参主要考虑以下方面：
（1）样本种属来源，哺乳动物的组织或者细胞样本，植物、昆虫等来源样本，适用的内参各不相同；
（2）目的蛋白分子量，通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上，此外，不同公司、同一公司不同货号的抗体相对分子量大小也会有些差异；
（3）目的蛋白表达部位，全细胞和胞浆蛋白、胞核蛋白、核膜蛋白、线粒体蛋白等都有对应的内参蛋白供选择；
（4）实际的实验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高；在凋亡实验时，Lamin B1等不适合作为内参；在加入抗癌和抗真菌药物时，β-Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参；（5）组织特异性，不同内参蛋白在不同组织中的表达可能不一样，因此不同的组织应选择不同的内参。
这里再放一张之前群友提供的内参选择图，建议收藏~
一区期刊:要求的整膜、未裁剪的膜
蛋白印迹(WB)是一种基于抗体的实验技术，用于检测和定量靶蛋白，靶蛋白通常在从细胞或组织中提取的复杂混合物中。虽然有许多新的替代技术，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光和质谱(MS)，但在一定程度上都有一定的局限性。ELISA缺乏加载控制，免疫荧光是一种原位技术，是半定量，而质谱昂贵，取决于实验技术和条件。因此，WB仍然是实验室中最常用的蛋白质检测方法。然而，许多科学期刊已经表达了对WB的担忧，以努力减少潜在的错误和增加可重复性的。在这里，我们将重点讨论WB实验中的一些基本注意事项。因此，本指南旨在为未来的实验和论文写作提供一个更新的、更简洁和可用的参考。
图1：具有代表性的WB。a. WB的过饱和条带。b. 空格（红色虚线）表示印迹拼接。c. 切割印迹。d. 完整的印迹。应避免印迹的过饱和暴露，以将条带信号强度（以光密度或荧光单位表示）保持在定量的线性范围内。建议进行旨在生成标准曲线的试验实验，特别是当使用新的抗体或方法时。图1a显示了一个过饱和条带的例子，它可能掩盖或至少减少了样品之间的差异。条带之间的比较（无论是否有统计学意义）和与加载对照之间的归一化只应在相同的印迹上进行。如果样品数量超过一个单一凝胶的容量，则相同数量的对照样品可以包含在单独的凝胶中。然而，与这个对照样本的比较仍然应局限于同一印迹内的样本。
单独的印迹永远不应该合并到一个图像中。如果在一个图面板中并排组织了多个斑点，那么它们之间应该有清晰可见的空间(如图所示1b)。如果某些通道包含与主题无关的数据，可以从印迹中剪出，但完整的印迹仍应根据期刊的要求提供给编辑或审稿人（图1c，d)。然而，如果这些不相关的通道位于印迹的中间，它们不应该被简单地移除。在这种情况下，凝胶应该用重新组织的样品重新运行。在所有的印迹图像上都应显示或标记分子量标记物的位置。如果印迹已被水平裁剪，则至少应显示两个相邻的标记位置（即，在条带的上方和下方），如图所示1c。
举例期刊对WB等结果的严格要求
现在越来越多的机构及期刊注重原始数据，尤其提示不能认为改变科学研究的结果。今天小编给大家介绍的这本SCI期刊JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY（J CELL BIOCHEM）便是提到了这一点，新更新的“作者须知”里面提到从2023年7月后都必须提供WB等的原始gel/blots图片，且保证重复率，若发现有人为修改的地方一律予以拒稿。1.报告WB和其他电泳结果：必须提供未经处理的图像(1)自2023年7月以来，本期刊要求发表凝胶电泳和/或blots结果的论文作者提供原始的未经处理的图像。作者应提交“原始图像检查”或可选择发表未经处理的图像在附件信息中。
(2)每个图片均需提供未切割的原始的免疫蛋白印迹。
来自J CELL BIOCHEM投稿要求
2.具体的Gel 和blots要求:
(1)所有图像必须有足够的分辨率和质量。
(2)重新排列条带或组合来自多个实验的图像，如从多个印迹中拼接来制作特定的实验结果，图像处理导致原始包含的信息失真或等的操作和编辑一般都是禁止的，期刊会立即拒稿，不会进一步送审。
(3)这种行为可能被认为是科学上的不端行为，需要进一步的调查。
(4)对照的Marker、阳性和阴性对照都应该包括在每个gel/blots中。
(5)重复性很重要。重复的结果作者应随时准备提交它们以供审查。重复的次数应在图注中清楚地标明。
来自J CELL BIOCHEM投稿要求
3. 定量和半定量
(1)不能笼统地说某一蛋白的表达水平“高”或“低”。
(2)所有的量化必须对属于线性响应范围内的信号进行 (例如，用于量化的波段不能过度曝光或过载)。
(3)不鼓励对不同凝胶进行定量比较；如有必须清楚说明。
来自J CELL BIOCHEM投稿要求
其他要求详见：
https://onlinelibrary.wiley.com/page/journal/10974644/homepage/forauthors.html#western