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外周血中PBMC细胞的分离流程

外周血中PBMC细胞的分离流程

血液组织介绍

血液做为循环流动在心血管系统内的红色不透明黏稠液态结缔组织,其主要由血浆和血细胞组成。其中血浆作为运载细胞,营养物质及代谢物的循环液体,主要成分是水(约占90%),其次是细胞蛋白,酶,激素等物质;另外的一部分是血细胞主要包含红细胞,白细胞及血小板三个大类。血液中血细胞的形态,数量,比例与血红蛋白含量称血象,很多疾病都会伴随血象的变化,所以血象检测也做为体外诊断筛查的一种重要形式。

在血细胞中存在着参与机体免疫应答,调控相关的一类细胞,我们统称为外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),是外周血中具有单个核的细胞(Mononuclear cell),包含了淋巴细胞和单核细胞(Monocyte)。因外周血中具有单个核的细胞在机体免疫中的重要性,所以单个核的血细胞成为很多科研工作者重点关注和研究的对象。

血液样本及血液组织示意图

根据单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同,红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右,单个核细胞的比重为1.075-1.090,血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液(密度梯度分离液或分层液)作密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,可将各种血细胞与单个核细胞分离。

参考耗材、试剂和仪器实验步骤样本准备:4 mL 全血/每样,正式分离 PBMC 时使用 2 mL,分两管进行;剩余 2 mL 留做备用。在室温平衡血液和 Ficoll(样本密度分离液) 30 min;冰上操作以下实验,在 15 mL 离心管中一次分别加入外周血和1× DPBS(外周血:1×DPBS=1:1)各 1mL,移液枪轻轻吹打5次稀释混匀。另取一只 15 Ml 离心管向底部添加 2 mL Ficoll (样本密度分离液),倾斜离心管至 30-45 度角,吸取 2 mL 1×DPBS 稀释的血液缓慢加入到 Ficoll (样本密度分离液)上层。将 15 Ml 离心管轻柔转移到高速冷冻离心机中,设置提速加速度设置为 9,减速加速度设置为 1,离心力 700 g ,温度20℃ 离心 20 min。离心完成后吸取 PBMC 细胞层(如下图)的细胞,转移至 15 Ml 离心管中,在离心管中加入 6 Ml 的 1640 (含5% FBS) 培养基,使用巴斯吸管轻柔吹打细胞悬液 3-5 次,重悬细胞。红细胞裂解:离心完成后,从离心机中取出离心管,观察离心后的细胞沉淀,如果细胞沉淀中有红色,准备进行红细胞裂解操作(参看裂红步骤I,II,III);收集后的细胞沉淀中没有红色,则可以不进行裂红处理,直接进入下一步。

红细胞裂解:

I.使用宽口枪头弃上清,加入300μl 1640培养基(含5%FBS)轻轻重悬细胞,后加入红细胞裂解液3mL,置于4℃(冰上),裂红计时 3min;如细胞悬液中红细胞较多(如:PBMC) 可以适当延长裂红时间至5min。II.裂红后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机(12℃,300g,5min)中低温离心收集细胞;如若细胞悬液中还有肉眼可见的红细胞沉淀掺杂其中,可重复步骤I,但裂红时间不可超过5min。III.裂红完成后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机(12℃,300 g,5 min)中低温离心收集细胞。清洗:离心完成后,从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管,巴斯吸管弃除上清;加入3mL-5mL 的1640(含5%FBS)培养基(注:按照每个米粒大小的细胞沉淀用量3mL的参考标准加入清洗培养基),使用宽口枪头(或巴氏吸管)重悬细胞后, 高速冷冻离心机(12℃,300g,5min)中低温离心收集细胞。重复1-2次步骤7对细胞进行清洗去除背景,清洗后的细胞悬液使用1640(含5%FBS)的培养基(注:按照每个米粒大小的细胞沉淀用量150μl的参考标准加入重悬培养基;如遇细胞量极少,甚至肉眼无法看到时可用60μl)重悬,置于冰上待计数上机。制备结果

细胞量:200万左右,活率95%以上,结团率5%

注意:联川生物几百例单细胞测序样本经验提示:离体后的外周血样本需在8小时内进行分离,尽量不要超过12小时,特别是做5’免疫组(VDJ)测序的样本最好在8小时之内分离。血样分离之后的 PBMC 可直接标记上机;也可在几个小时内放置,但标记上机前需做一次清洗,也可以根据课题设计进行细胞冻存,后续复苏后标记上机。不同组织中细胞离体后耐受性不一,所以,细胞是否可以冻存复苏后再进行单细胞测序,需要根据复苏后的活率变化,细胞量变化决定。

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