不可切除胃癌病人预后差，曲妥珠单抗联合化疗是目前标准治疗模式，但该联合方案的生存获益有限。免疫治疗被认为是肿瘤治疗中最具前景的治疗方法，然而其在胃癌中的应用仍不理想，且缺乏筛选有效人群的理想生物标记物。微卫星不稳定性(MSI)及程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平在多种肿瘤中显示出与免疫治疗效果密切相关，但目前关于胃癌病人HER2状态、MSI状态及PD-L1表达情况相关性研究报道较少。本研究旨在验证二代测序(NGS)与免疫组织化学(IHC)技术在胃癌HER2状态评估中的一致性，分析HER2阳性胃癌组织中MSI状态、PD-L1表达与临床病理特征的关系。
1 资料与方法 1.1 一般资料使用关键词“胃癌”、“大标本”、“HER2”在青岛大学附属医院病理资料数据库中搜索2013年1月—2017年12月行胃癌手术的病人，共搜索到病人1 390例。所有病人术后大标本均已进行HER2的IHC检测，其中105例病人的组织标本为HER2(3+)，即HER2阳性，选取92例术前未行放化疗的HER2阳性胃癌病人纳入本研究。入组的92例病人中，男性75例，女性17例; 年龄35~87岁，中位年龄64岁; AJCC第8版分期Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例; Lauren分型肠型58例，弥漫型12例，混合型21例; 腺癌82例，黏液腺癌5例，印戒细胞癌5例; 高分化2例，中分化39例，低分化51例。
1.2 NGS检测HER2基因有无扩增及MSI状态 1.2.1 组织DNA提取石蜡组织切片行脱蜡、刮片、消化、升温、离心等处理，收集洗脱液于无菌离心管中，进行NGS检测。
1.2.2 文库构建先将基因组DNA进行超声片段化处理，然后进行末端修复、3′端加A、添加接头以及PCR扩增，得到预文库。预文库在探针作用下进行16~24 h的杂交，抓取出检测所需的目的片段，最后给靶序列加上测序所需的分子标签，完成文库构建。
1.2.3 基因测序使用IlluminaNextseq 500/550测序仪以快速模式进行大规模平行测序。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机软件将光学信号转化为测序碱基。
1.2.4 数据分析NGS检测会产生大量的原始序列数据，将原始序列数据进行初级处理，过滤后得到clean data(删除质量不好的原始数据后得到的数据，常见的删除方法有去接头、去N含量高及质量评分较低的原始数据等)。对clean data进行序列比对并捕捉基因点突变、缺失、插入、拷贝数变化、结构变异等多种变异信息，并注释。用SPSS 22.0软件进行结果分析。
1.3 IHC检测PD-L1蛋白表达应用22C3抗体浓缩物在Dako ASL48自动染色仪中对组织标本进行染色，将染色结果与Dako ASL48平台上的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒进行比对以评估PD-L1表达。IHC检测均设阳性对照和阴性对照。
1.4 检测结果判定 1.4.1 HER2基因扩增及MSI状态① HER2基因扩增：拷贝数/细胞2.75~3.00，且一个基因60%以上的探针捕获区域(bin)在癌症样本中的覆盖深度显著高于基线水平，同时整个基因区域的覆盖水平与基线水平差异具有统计学意义。②MSI状态：40%以上MSI基因座(loci)长度不稳定，则认为是微卫星高度不稳定(MSI-H); 小于15% MSI loci长度不稳定，则认为是微卫星稳定(MSS); 如果长度不稳定的MSI loci在15%~40%之间，则认为是微卫星低度不稳定(MSI-L)。
1.4.2 PD-L1表达阳性① 组合阳性评分(CPS)：PD-L1染色细胞(包括肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的数量除以活肿瘤细胞总数再乘以100。如果CPS≥1，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。②肿瘤比例评分(TPS)：相对于样品中存在的所有肿瘤细胞中PD-L1阳性细胞(具有(1+)~(3+)强度的全部或部分细胞膜染色的活肿瘤细胞)的百分比。如果TPS≥1%，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。
1.5 统计分析用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果 2.1 HER2基因扩增情况本研究IHC检测HER2(3+)胃癌病人92例，NGS检测显示84例病人存在HER2基因扩增，8例病人未显示HER2基因扩增，IHC与NGS检测结果的一致性为91.3%。HER2基因扩增病人中合并HER2基因错义突变者10例(10.7%)，合并基因融合者17例(20.7%)，同时合并基因错义突变与基因融合者1例(1.1%)。
2.2 MSI状态与HER2基因扩增的关系