2004年诺贝尔化学奖授予57岁的阿龙·切哈诺夫（Aaron Cichanover）及67岁的阿夫拉姆·赫什科（Avram Hershko）两位以色列科学家和78岁的美国科学家欧文·罗斯（Irwin Rose），表彰他们发现并在分子水平上认识细胞是怎样调控细胞内某些蛋白质作为靶分子，在特定时间和特定场所被分解的. 这一过程称为泛素调节的蛋白质降解.
切哈诺夫等三人的工作,使人们了解细胞是怎样控制着许多极其重要的生物化学过程,其中如:细胞周期、DNA修复、基因转录、新生蛋白质的质量控制以及免疫应答等. 如果系统中的蛋白水解功能出现缺损,将给人带来包括癌症在内的多种疾病.
1 蛋白质的合成与分解
蛋白质是普遍存在于生物界的高分子化合物. 生物体的各种结构和功能都是通过蛋白质分子实现的, 所以说蛋白质是生命的物质基础.
蛋白质在体内的含量不仅远多于携带有遗传信息的核酸, 并且种类繁多, 估计有数十万种, 它们分别执行不同的生理功能, 如具有催化机体内化学反应的酶, 作为生长发育信号物质的激素, 在机体免疫防御系统中的抗体, 而且也和细胞的结构和形态有关.
100多年来, 人们对于蛋白质的结构和合成的研究已经取得很大成就, 尤其是它的合成, 近年来，多项诺贝尔奖涉及蛋白质合成. 实际上, 机体内的蛋白质合成和分解是同时在不停地进行着, 保持一种动态平衡. 因为在适当位置和时间合成蛋白质的数量是受到严格限制的, 并且各种蛋白质都有其自身的寿命, 完成使命后就要被清除. 细胞不但要清除自身代谢产生的蛋白, 而且要随时清除外界袭来的微生物, 再加上细胞合成蛋白质时由于转录和翻译的错误也会出现废品. 因此, 只有清除这些无用蛋白质, 才能准确调控细胞内蛋白质的种类和数量, 才能使细胞维持正常生长. 然而与合成一样重要的蛋白质分解过程却长期以来很少有人深人研究.
2 问题的提出：蛋白降解是否需要能量
人们很早就知道生物体内存在着某些能够降解蛋白质的酶, 其中如在小肠中负责降解食物蛋白的胰蛋白酶;存在于细胞内能降解细胞外部的蛋白质和膜蛋白的溶酶体, 它们在进行酶反应时是不需要供给能量的. 与上述情况相反, 许多细胞内蛋白质的降解是要求代谢能的. 这一现象是1953年Simpson在用培养的肝切片进行实验时发现的, 即他们观察到细胞本身的蛋白质在分解时总是依赖能量的. 显然, 这在当时看来是一种非正常蛋白水解过程, 而且一直困惑着研究人员. 正是这一神秘的未知, 才促使赫什科在读博士后时选择了有关内容进行研究, 并奠定了这次诺贝尔化学奖的基础.
3 实验材料—网状细胞溶胞物
赫什科最初使用的实验材料是以肝细胞瘤切片为底物, 一段时间后改用新发现的更适宜作为研究材料的网状细胞溶胞物(riticulcoyte lysaste). 但这时的研究工作已由以色列工学院转移到实验条件更好的, 位于美国费城的福克斯·切斯癌症研究中心的罗斯实验室. 网状细胞溶胞物首先是由Etlinger和Goldberg于1977年开发出的用于研究能量依赖蛋白降解的实验方法. 它是从兔的未成熟红血球中提取出的脱细胞提取物, 它能以ATP依赖方式分解异常蛋白质. 由于ATP是细胞可利用的惟一能源, 它分子中的高能磷酸键, 在水解时可产生能量, 故ATP依赖反应是需能量的. 赫什科在罗斯实验中和切哈诺夫、罗斯一起应用这种溶胞物展开一系列重要的、划时代的研究.
4 APE一1与泛素
1977年切哈诺夫等人在采用网状细胞溶胞物进行实验时,由于感到其中可能含有多量干扰实验的血红蛋白,但在用色谱分离法企图把它除去时,却惊奇地发现溶胞物在色谱柱上被分成两个组分,而且每一组分本身并无活性,只有两个组分重组后才能启动Al,p依赖蛋白降解. 1978年他们报道了其中称为组分一1中的活性成分是相对分子质量约9000的热稳定性多肽,并命名为APF一l(active principle of fraction l).
1980年切哈诺夫等人又报道了他们具有决定性的发现:即APF一l是以最稳定的化学键—共价键方式和溶胞物中的多种蛋白质相连接,而且同一靶蛋白分子上还能连接多个APF一1,然而到这时对于APF一1的功能还是一无所知的,只是到1980年才由Wilkinson等人证明它是早已发现的称为泛素(Ubiquitin；Ub)的物质. 泛素最早是在1975年由Goldstein从牛胸腺中分离出的,此后又发现它存在于不同组织和多种生物体中,因此给出这一名称,拉丁语Ubique是无处不在之意.
图2 泛素空间结构泛素是一种多肽, 由76个氨基酸构成, 分子质量为8.45ku,其空间结构如图2所示. 是高度紧密的球蛋白,其羧基末端向外伸出,以便与靶蛋白连接,另外分子内存在许多氢键,整个结构不柔曲,因此具有较高热稳定性和广泛pH耐性.
泛素的功能最初只是认为可能参与了淋巴细胞的分化,但现在已知,通过多个泛素连在同一靶蛋白分子上即发生多泛素化(polyubiqitination)后,不仅使蛋白质变性和打上标记,而且给出一个触发信号,使蛋白酶体(porteaasome)识别而把它分解. 我们可以说,这种泛素标记化,对于蛋白质来说就是一个“Kiss of death”.
5 酶系统
赫什科等人在获得上述未曾料到的重大发现之后,改变了原来的工作计划,集中研究催化泛素与靶蛋白分子结合的酶系统上来. 因为这时已经知道,泛素的存在是如此普遍,那么泛素与蛋白质结合及使之降解的作用,对于细胞更是一个具有普遍意义的课题.
赫什科等人在报道了分离网状细胞溶胞物所得组分—1的情况一年之后,又报道了所得溶胞物的另一组分,即组分—2的情况,他们发现:可以用盐沉淀法把组分—2进一步分成两个子组分. 子组分之一是能被ATP稳定化的蛋白质,分子质量约4501kDa,但这一组分是到10年后才知道可能是蛋白酶体. 另外一个子组分中则含有三种酶,随后把它们一一分开并加以鉴定. 它们是: 泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme, 简称E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, 简称E2)、泛素蛋白连接酶(ubiquitin protein ligating enzyme, 简称E3). 3种酶在蛋白质降解过程中分工不同. E1负责激活泛素分子, 泛素分子被激活后被送到E2上. E2负责把泛素分子绑在被降解的蛋白质上. 但E2并不认识被降解的蛋白质, 而E3具有辨认被降解蛋白质的功能, 就需要E3帮助. 当E2携带泛素分子在E3的指引下接近被降解的蛋白质时, E2就将泛素分子绑在被降解的蛋白质上. 如此循环往复, 被降解蛋白质上被绑了一批泛素分子. 当泛素分子达到一定数量后(一般认为至少5个), 被降解蛋白质就被运送到细胞内的一种被称为蛋白酶体的结构中进行降解.
6蛋白酶体
蛋白酶体被称为“垃圾处理厂”, 通常一个人体细胞内大约含有30000个蛋白酶体, 1979年由Goldberg等人首先分离出来. 蛋白酶体包括两种形式:20S复合物和26S复合物, 而26S复合物又由20S复合物和19S复合物组成, 主要负责依赖泛素的蛋白质降解途径. 26S复合物是一种筒状结构, 活性部位(20S复合物)在筒内, 能将所有蛋白质降解成含7个～9个氨基酸的多肽. 蛋白质要到达活性部位, 一定要经过一种被称为“锁”(lock)的帽状结构(19S复合物), 而这个帽状结构能识别被泛素标记的蛋白质. 被降解蛋白质到达活性部位后, 泛素分子在去泛素酶的作用下离去, 能量(ATP)被释放出来用于蛋白质的降解. 降解后的多肽从蛋白酶体筒状结构另一端被释放出来. 其实, 蛋白酶体本身不具备选择蛋白质的能力, 只有被泛素分子标记而且被E3识别的蛋白质才能在蛋白酶体中进行降解.
图3 蛋白酶体7 蛋白质降解机理
蛋白质在细胞内完整的降解过程可用图4来说明.
(1) 酶E1激活泛素分子. 此过程需要ATP能量.
(2) 泛素分子被激活后被运送到E2上. E2负责将泛素绑在被降解的蛋白质上.
(3) E3能识别被降解的蛋白质. 当E2携带泛素分子在E3的指引下接近被降解蛋白质时. E2就把泛素分子绑在被降解蛋白质上(标记).
(4) 酶E3释放出被泛素标记的蛋白质.
(5) 不断重复上述过程. 直到蛋白质上绑有一定数量的泛素分子后被送到蛋白酶体.
(6) 蛋白酶体接收被泛素分子标记的蛋白质并将其切成由7个～9个氨基酸组成的短链.
图4 蛋白质降解机理8发现的意义：揭示生命奥秘，有助攻克疾病
人们很快发现很多泛素调节蛋白水解系统的生理底物,下面介绍其中几个特别重要的例子.
8.1控制细胞周期
细胞增殖周期简称细胞周期(Cell cycle),它是指细胞分裂的开始至下一次细胞分裂开始之间的期限. 细胞增殖是生物的基本特征,是生命延续的基本保证. 细胞通过分裂将细胞中复制的遗传物质和分裂的细胞质均等地分配到两个子细胞来进行增殖,所以如果没有细胞分裂也就没有生物的生长、发育、繁殖.1991年Goebl等人以确切证据证明,能调控细胞周期的一种称为周期素(Cyciln)的蛋白质是受泛素调节蛋白水解系统控制的. 当细胞分裂中期及后期间的临界处时,周期素即被降解,其活性突然受到抑制,从而结束丝裂期,转人周期的下一阶段. 另外,细胞分裂过程中,E3酶也扮演着重要角色. 染色体在有丝分裂或减数分裂期如果发生错分离(mis一segregation)将会畸变细胞中染色体数,导致孕妇自发性流产. 如果错分离发生在外21染色体,将造成胎儿的唐氏先天愚症(Down’s syndrome). 多数恶性实体瘤细胞中,也由于染色体数目变异,使细胞在丝裂期重复地错分离.
8.2.DNA修复、癌症和细胞凋亡
细胞凋亡(apoptoiss)又称程序性细胞死亡(programmed cell death)是一种基因控制的细胞自主性死亡过程. 细胞凋亡作为生理现象,在维持机体自身稳定上发挥重要作用. 细胞凋亡受到抑制可引发癌症.
称为“基因卫士”的5P3蛋白是一种抑癌蛋白,它在正常细胞中由于不断地生成和分解,故含量很小. 它在分解时先与E3酶形成复合物,然后按泛素调节蛋白水解过程分解. 当DNA损伤时,P53蛋白则发生磷酸化,停止与E3酶结合,P53蛋白也就不再被水解,以至它的含量在细胞内迅速增加,进而起到抑制癌细胞生长作用. 但是在人的癌细胞中至少存在有50%发生突变失活的P53蛋白,导致癌细胞增殖不能有效抑制. 5P3蛋白在一定条件下还能抑制细胞周期进程,如果细胞内出现DNA损伤,就会诱导产生P53蛋白;于是随着细胞周期停滞,DNA就有时间修复,如DNA损伤过大,则启动细胞凋亡.
人乳头瘤病毒(HPV)是引起性传播疾病的一种病毒,它的感染与人的子宫颈癌密切相关. 这种病毒致癌,在于HPV体内的病毒蛋白能激活称为E6-AP的另一种E3酶,它能导引P53蛋白泛素化和降解,结果是感染病毒细胞的DNA损伤不能正常修复和凋亡,致使突变累积和癌变.
8.3 免疫应答和炎症反应
作为转录因子的NF一kB蛋白能调控细胞中多种在免疫应答和炎症反应中起重要作用的基因. 如果NF一kB蛋白在细胞浆中和一种作为抑制因子的IkB蛋白形成复合物就会失去活性. 但是一旦细胞受到细菌或病毒感染时,IkB蛋白就会发生泛素化和磷酸化,进而被蛋白酶体分解. 剩余的NF一kB蛋白则转移到细胞核中,在这里活化后执行一定的基因表达来抗御感染.
泛素一蛋白酶体系统还能通过分解病毒蛋白,产生出一些肽类物质,这些肽类能被T淋巴细胞等识别和吸收,成为人们防御病毒感染的重要成分. 因此泛素一蛋白酶体系在人类免疫和抗炎症反应上起着巨大作用.
8.4 新药研发
泛素调节系统现在已成为新药开发中一个令人关注的领域. 例如研制出的药物能指向泛素调节蛋白降解系统中的某一组分;以期防止某种特定蛋白质分解,反之,这种药物能启动这一系统去分解某种有害蛋白质.维尔卡(Velcade;PS341)就是一种蛋白酶体抑制剂,用于治疗侵袭机体抗原生产细胞的癌症—多发性骨髓瘤上.
泛素调节的蛋白质降解过程在生物体内的作用非常重要 ,对它进行研究也就具有特殊的意义. 当前也不断地有科研成果涌现出来，用于治疗疾病、开发药物，应用前景非常广阔.