荧光成像自其出现开始就已成为生物研究的一个主要工具。它帮助了无数科学家从微观水平观察细胞结构和动态过程。
如果您曾使用荧光显微镜对生物样品进行成像，您甚至可能注意到组织中弥漫着微弱、无处不在的背景信号。该信号在不同结构中的强度不同，并且其强度可能会根据您激发源的波长而呈现变化。
然而，在您检查方案和笔记中出现的染色技术问题前，请考虑您样品的生物组成。它是否为细胞化构成？是否有色素？是否存在大量结构蛋白？如果您对这些问题中的任何一个回答“是”，那么您所看到的信号可能并不像自己想象的那样陌生。这些背景信号大多数都是天然发出的自发荧光。
生物学比您想象的更明亮―自发荧光定义自发荧光是生物结构天然发出的光，是广泛存在于细胞和组织中的一种现象。这种现象由内源性分子组成成份呈现的荧光能力引起。与染色剂和染料中使用的经过设计的荧光染料一样，自发荧光分子通常包含多环碳氢化合物，具有可被入射光子激发的离域电子。自发荧光分子在受到入射光刺激后，会显示出对有效振动弛豫的耐受。因此，多余的能量会作为一个新光子被发射出去，与激发的光子相比，这种光子能量比降低，波长升高。虽然这些机制听起来很熟悉，但您可能会质疑，为何在日常生活中没有遇到过自发荧光。毕竟，您自己就是一个生物实体。然而，您并不会轻易发出荧光。
目前已知，有少数内源性分子（如甲壳素），在紫外线刺激下会发出荧光（见图1，左）。然而，与科学家们更习惯在实验室看到的经过设计的荧光染料相比，许多自发荧光体不太可能被入射光子激发。经过设计的造影剂的浓度同样可以在台式染色方案中进行调整，以限制或加强荧光信号，但天然自发荧光始终受生物浓度限制。
图1. 活体样品中的自发荧光示例。左图：紫外线（UV）刺激下蝎子的自发荧光。右图：外伤后10天的大鼠皮肤恢复图像，显示新血管在表皮层向伤口切口垂直生长。蓝色（DAPI）：细胞核。橙色（自发荧光）：皮肤组织。红色（CD31）：血管。使用奥林巴斯BX51宽场荧光显微镜和DP71相机拍摄的图像。图像承蒙中国中医科学院实验研究中心LiShuang Li提供。
尽管大多数自发荧光在紫外-绿光范围内可以被激发，但自发荧光分子也有明显的激发窗口，并形成相对广泛的激发光谱。以上因素结合在一起，使得在使用带有专用荧光刺激光源和比肉眼更敏感的光子探测器的成像系统时，更容易遇到自发荧光现象（图1，右图：橙色信号）。
生命科学研究中常见的自发荧光来源为了顺应研究成像实验中的自发荧光现象，您要考虑样品包含的生物组成成份。以下是研究人员在实验室中经常观察到的一些产生自发荧光的物质：
1.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，或称NAD（P）H，是一种分布于细胞质中的代谢辅助因子和电子载体，它是糖酵解和磷酸戊糖途径的一个关键组成成份。作为细胞代谢的一个关键组成成份，这意味着NAD（P）H的自发荧光现象几乎存在于所有活细胞中。为了执行其代谢功能，该分子以氧化（NAD+）和还原（NAD（P）H）状态天然存在。然而，只有NAD（P）H能够产生荧光。其对应的氧化物NAD+则不会产生自发荧光。激发：340纳米；发光：450纳米。（资料来源：Chance 等人，1979；Georgakoudi 等人，2002）。
2.黄素类物质通常以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在，这种代谢辅酶在TCA循环和电子输送链中发挥重要作用。它主要位于线粒体中，其中活跃的代谢过程产生自发荧光信号热点。有些研究人员更愿意将黄素类物质的自发荧光称为“黄素蛋白荧光”，因为FAD在功能上与线粒体中的蛋白质复合物（如琥珀酸脱氢酶）结合。与NAD（P）H的情况相反，FAD只有氧化形式会产生荧光，而还原形式则不会。激发：380-490纳米；发光：520-560纳米。（资料来源：Chance 等人，1979；Deyl 等人，1980）。
3.胶原蛋白胶原蛋白是一种关键的机械蛋白，可进行组装，创建各种支撑结构基质供大多数组织使用。它可见于皮肤的真皮层、内部器官的细胞外基质和周围血管系统。它也包含肌腱、韧带、头发和指甲。虽然在细胞培养物中很少看到胶原蛋白，但使用体内样品或整个组织进行成像实验的研究人员可能会发现胶原蛋白自发荧光现象不可避免。激发：270纳米；发光：390纳米。（来源：Georgakoudi 等人，2002）。
4.弹性蛋白作为另一种突出的细胞外基质（ECM）蛋白，弹性蛋白经常与胶原蛋白夹杂在一起，使细胞外基质具有